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NPG 小鼠

1.基本信息

(1)品系名称:NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Vst/Vst

(2)常用名:NPG小鼠

(3)背景:NOD

(4)毛色:白色

(5) 品系建立:NPG小鼠,是北京维通达生物技术有限公司自主研发的一系列高度免疫缺陷大小鼠模型之一,将获得的Il2rg基因敲除小鼠,回交到NOD-scid背景建立的高度免疫缺陷模型。使用该小鼠模型已经发表了一系列高水平研究论文[1~12]。


2.制作简介

首先构建了Il2rg基因打靶载体,在B6/129 F1背景的ES细胞上,筛选得到将Il2rg基因敲除的阳性打靶细胞(见图1)。通过囊胚注射的方法,获得了Il2rg基因敲除的ES嵌合小鼠。然后,将ES打靶小鼠,与NOD-scid小鼠回交,从后代中选择Il2rg因基敲除鼠,再与NOD-scid小鼠回交。通过12代的回交,获得并选择Il2rg-雄鼠和Il2rg+/-雌鼠交配,获得PrkdcscidIl2rg-/-小鼠。随后,NOD.PrkdcscidIl2rg-/- 小鼠按照近交系的方式扩繁生产。

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图1. Il2rg 基因打靶策略示意图



3.质控检测和表型分析

NPG小鼠主要包括两个基因突变,(1)Prkdc基因的点突变,在84号外显子上,TAT→TAA,产生了一个无效的包含83AA的删短蛋白;(2)Il2rg基因小鼠,3-8外显子的编码区被删除。NPG小鼠的SNP分析结果见表1,与NOD-scid (NOD.CB17- Prkdcscid/NcrCrlVr)小鼠一致。


表1. NPG 和NOD-scid 小鼠SNP分析结果。


SNP ID

Chr-cM

Allele

NPG

NOD-scid

1

RS8253473-SNP1

1-80

V=A, F=C

F F

F F

2

RS13476104-SNP1

1-128

V=C, F=T

V V

V V

3

RS13476435-SNP1

2-35

V=A, F=T

F F

F F

4

RS13476730-SNP1

2-119

V=A, F=T

V V

V V

5

RS13477470-SNP1

3-146

V=A, F=G

V V

V V

6

RS13478001-SNP1

4-135

V=C, F=T

V V

V V

7

RS13478215-SNP1

5-42

V=A, F=C

F F

F F

8

RS13459087-SNP1

5-86

V=A, F=G

F F

F F

9

RS13478818-SNP1

6-73

V=C, F=G

F F

F F

10

RS3710839-SNP1

6-121

V=A, F=G

V V

V V

11

RS3666902-SNP1

7-15

V=T, F=C

VV

VV

12

RS8260975-SNP1

7-34

V=A, F=C

V V

V V

13

RS13479791-SNP1

8-60

V=A, F=G

F F

F F

14

RS4227276-SNP1

8-80

V=C, F=T

F F

F F

15

RS8254841-SNP1

9-38

V=A, F=T

F F

F F

16

RS13480385-SNP1

9-103

V=C, F=T

V V

V V

17

RS13480546-SNP1

10-24

V=C, F=T

F F

F F

18

RS13480803-SNP1

10-123

V=C, F=T

V V

V V

19

RS13480933-SNP1

11-25

V=C, F=G

V V

V V

20

RS3653651-SNP1

11-102

V=C, F=T

F F

F F

21

RS13481624-SNP1

12-99

V=C, F=G

F F

F F

22

RS13481852-SNP1

13-63

V=A, F=C

V V

V V

23

RS13482131-SNP1

14-30

V=C, F=T

V V

V V

24

RS13459176-SNP1

15-3

V=A, F=C

V V

V V

25

RS4170048-SNP1

16-32

V=C, F=G

V V

V V

26

RS13482843-SNP1

17-4

V=C, F=T

V V

V V

27

RS13483295-SNP1

18-35

V=G, F=T

V V

V V

28

RS13483601-SNP1

19-34

V=A, F=G

F F

F F

29

RS13483739-SNP1

X-40

V=C, F=T

V V

V V

30

RS13483962-SNP1

X-109

V=A, F=C

F F

F F



NOD(non-obese diabetes) 背景适宜人源细胞移植[13];Prkdc基因突变,小鼠T、B细胞缺失[14,15];Il2rg蛋白的gamma链被敲除,其NK细胞活力几乎丧失[16,17]。因而其基因检测和表型分析主要集中在4个方面:①NOD背景(SNP检测);②Prkdc点突变(PCR检测;T、B细胞缺失的流式检测);③Il2rg敲除(PCR检测,功能性NK细胞缺失的流式检测);④细胞移植重建分析。


(1) NOD背景检测                                   

NPG小鼠制作使用的NOD-scid小鼠,其遗传检测数据见右上30个SNP(single nucleotide polymorphism)位点信息表,这些位点遗传标记分布于20条染色体。


(2) Prkdc点突变、Il2rg敲除和NOD背景(Sirpa基因)检测

Prkdc点突变小鼠, 1983年由福克斯蔡斯癌症中心(Fox Chase Cancer Centre)的Bosma等人发现[14,15]。Prkdc(protein kinase DNA-activated catalytic)基因突变,小鼠的T和B细胞缺失 ,表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency, scid)。Il2rg敲除小鼠表现为胸腺发育不全,NK细胞数量减少,活性丧失[16,17]。目前Prkdc点突变常用的检测方法为PCR检测;蛋白水平的检测最方便的是流式分析其外周血中T、B淋巴细胞的含量。Il2rg敲除常用的检测方法为PCR检测;蛋白水平的检测最方便的是流式分析其脾脏中NK细胞的含量和活性。NPG小鼠采用上述方法进行质控,结果见下图。


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                         2 Prkdc基因PCR检测                                 图3 Il2rg基因PCR检测


            image.png

            图4  NOD背景(Sirpa基因)检测


(3) T、B和NK细胞检测

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图5  NPG小鼠缺失有功能的T、B和NK细胞。流式分析B6, Balb/c nude和NPG小鼠外周血中CD3+ CD4+ or CD3+CD8+ T 细胞 , B220+ B 细胞和NKp46+ NK 细胞的含量。



(4) 造血干细胞移植重建和肿瘤细胞移植数据


 ① NPG小鼠移植人造血干细胞效果显著优于NOD-scid小鼠。


 image.png

图6 NPG和NOD-scid小鼠移植人造血干细胞,第12周时人CD45+细胞嵌合率分析。左图为移植后12周时外周血中人CD45+细胞比例的流式分析结果;右图为骨髓中人CD45+细胞的比例。

 


②人造血干细胞(HSCs)移植NPG小鼠高水平重建造血系统

图7  NPG小鼠移植人造血干细胞(HSCs)后,可以高水平重建造血系统。左图为将 5×104脐带血CD34+细胞通过骨髓移植入6-8周的NPG小鼠后检测结果; 右图为1×105脐带血CD34+细胞移植后16周在NPG小鼠脾脏中检测到高水平的人CD45+细胞



③人造血干细胞(HSCs)移植NPG小鼠后重建各系造血细胞比例检测

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图8人造血干细胞(HSCs)移植NPG小鼠后获得各系造血细胞分化的高水平重建。上图显示的为将5×104脐带血CD34+细胞移植16周后,在NPG小鼠外周血中检测到高水平的人CD45+细胞(46.54%)、CD19+ B细胞(70.9%)、CD3+ T细胞(17.33%)和CD33+髓系细胞(8%)。



333.pngimage.png

图9 人造血干细胞(HSCs)移植NPG小鼠后各系细胞重建。脐带血CD34+细胞移植NPG小鼠12周以及更长时间之后,人源造血细胞稳定重建,T细胞所占比例逐渐升高。



④NPG小鼠更适合于肿瘤免疫治疗的相关研究


image.png       image.png

10 人肿瘤细胞移植NPG小鼠后更容易成瘤。上图为使用NPG小鼠和BALB/c裸鼠,皮下接种人黑色素瘤细胞A375SM后,活体成像的肿瘤示踪图,可见NPG小鼠成瘤,与裸鼠相比,大小更均匀,生长到一定体积需要的时间相对更短。



4. 应用领域

(1)人源细胞或组织移植

(2)肿瘤和肿瘤干细胞研究

(3)ES和iPS细胞研究

(4)造血和免疫学研究

(5)人类疾病感染模型研究

(6)人源化动物模型研发


5. 参考文献

1. CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia.Xu L, Wang J, Liu Y, Xie L, Su B, Mou D, Wang L, Liu T, Wang X, Zhang B, Zhao L, Hu L, Ning H, Zhang Y, Deng K, Liu L, Lu X, Zhang T, Xu J, Li C, Wu H, Deng H, Chen H.N Engl J Med. 2019 Sep 26;381(13):1240-1247. doi: 10.1056/NEJMoa1817426. Epub 2019 Sep 11.

2. Chimeric Antigen Receptor-modified T Cells Repressed Solid Tumors and Their Relapse in an Established Patient-derived Colon Carcinoma Xenograft Model.Teng R, Zhao J, Zhao Y, Gao J, Li H, Zhou S, Wang Y, Sun Q, Lin Z, Yang W, Yin M, Wen J, Deng H. J Immunother. 2019 Feb/Mar; 42(2):33-42. doi: 10.1097/CJI.0000000000000251.

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8.CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo.Xu L, Yang H, Gao Y, Chen Z, Xie L, Liu Y, Liu Y, Wang X, Li H, Lai W, He Y, Yao A, Ma L, Shao Y, Zhang B, Wang C, Chen H, Deng H.Mol Ther. 2017 Aug 2;25(8):1782-1789. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.04.027. Epub 2017 May 17

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11.Efficient derivation of embryonic stem cells from NOD-scid Il2rg (-/-) mice. Protein Cell. 2015 Dec;6(12):916-8. doi: 10.1007/s13238-015-0209-6.

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