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基因编辑技术

维通达公司拥有4种主要基因修饰技术,可根据您的实验要求,量身设计方案,采用最合适的编辑方法,准确,高效的制备目标动物模型。

ES 细胞打靶

ES细胞是全能胚胎干细胞,该细胞可以通过胚胎嵌合,获得ES细胞来源的小鼠。因此可以在ES上进行基因编辑,获得基因修饰小鼠。该方法在CRISPR等技术出现之前,是唯一获得靶向基因修饰小鼠的方法。


技术一般的流程

载体构建→ 电转ES→ 克隆鉴定→ 嵌合鼠制备→ ES小鼠获得

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图1 经典ES打靶制备基因修饰小鼠模型流程,目前维通达可提供2种遗传背景的小鼠ES细胞:C57BL/6,B6;129。



EPS细胞打靶

EPS细胞是一种全能性比普通ES更高的干细胞。相比于普通ES具有种系传递能力强,打靶效率高的特点。它可以有效缩短基因小鼠制备周期,降低制备费用。在制备基因敲入,条件敲除方面,效率远远高于CRISPR法,更为重要的是不受敲入片段大小限制,是一种新型高效的基因修饰大小鼠制备策略。

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图1 EPS制备基因修饰小鼠流程图。


技术优势或适合应用的研究

-在制备基因敲入,条件敲除方面,效率远远高于CRISPR/Cas9法。

-更为重要的是不受敲入片段大小限制。

-对于需要多次打靶的复杂动物模型,制备周期更短。


ES VS. EPS细胞打靶技术

EPS:维通达获得EPS独家技术指导,成功将EPS应用于基因编辑小鼠快速制备中,EPS是潜能拓展的多功能干细胞,2017年在cell上发表该项研究成果,期刊号:169(2):243-257.e25.

-ES打靶效率一般在百万分之一的级别,与之相比,EPS基因打靶效率提高几十倍到上百倍。

-同时EPS因为更高的全能性,具有更强的种系传递能力,低至1颗EPS细胞,就可一步获得嵌合效率接近100%的ES小鼠,省去种系传递过程(三个月)。

-与CRISPR辅助技术相比,使用EPS细胞不再受限于敲入片段大小,周期可控,结果可预测。


EPS和ES策略流程

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 EPS恒久远,一颗永流传。    


CRISPR/Cas9技术

CRISPR/Cas9能够靶向基因组的特定序列,并且将DNA双链打断,引发非同源末端修复,提高同源重组修复效率。可用于基因敲除,小片段基因敲入和基因条件敲除等基因编辑。


技术一般的流程

载体构建→设计制备gRNA→微注射→出生小鼠检测→阳性小鼠获得。


技术优势或适合应用的研究

-高效率基因敲除,双gRNA策略能够删除大片段DNA,从几十bp到Mb,几乎没有长度限制。

-基因敲入严重依赖片段长度,1kb以上,敲入效率急剧下降。

-点突变等小范围基因编辑效率高。


成功案例


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图1 双gRNA切割,片段敲除基因方案设计。

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图2 两个Grna切割位点之间的~550bp基因序列被高效率敲除,相对于野生带773bp,发生敲除的鼠PCR产生~220bp的条带。


病毒转基因

脂质体细胞转基因方法是常用的方法,但对于一些肿瘤细胞系,效率极低。病毒转基因成为有效的替代方案,常用的有慢病毒,腺病毒方法.慢病毒会把外源基因整合到细胞,常用来建立转基因细胞系、细胞荧光标记等用途。腺病毒不整合到基因组,可以用来瞬时转染细胞。腺病毒制备较慢病毒复杂,周期长。


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图1 通过慢病毒,把luciferase转到Raji细胞,建立稳转细胞系。