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冻存和复苏

保种服务是指,通过在液氮中保存实验动物的配子或胚胎,从而实现以较小的成本维持动物模型核心种群的方法。维通达通过冻存精子,胚胎或卵巢组织,需要时再复苏成活体动物,确保客户种质资源的安全。


1.胚胎冻存

胚胎冻存是最早的和最安全的保存实验动物品系的方法。影响胚胎冷冻保存成功的三个重要方面包括:①胚胎的数量;②复苏后存活胚胎的数量;③胚胎移植后存活的成年动物数量。

维通达建议客户每个品系冻存约200~300枚2cell、8cell或桑囊胚时期的胚胎,每管30枚左右,即8~10管胚胎放入液氮中保存。胚胎的来源,既可以通过超数排卵的方法,或者通过体外受精(IVF)的方法获得。当然,也可以与品系净化结合起来,这样可以节约获得足量数目胚胎的准备成本。


该技术的流程包括:

①胚胎采集。维通达建议冻存2-cell胚胎。若2-cell胚胎复苏效果不佳,再考虑冻存8cell或桑囊胚时期的胚胎。

②胚胎清洗。我们采用国际胚胎移植协会的建议方案进行清洗,目的是防止胚胎被微生物感染。

③胚胎冻存。采用玻璃化冷冻进行,按照标准的流程经过冻存保护液处理后,投入液氮保存。

④复苏验证。冻存一周后,我们取出1支验证管的胚胎进行复苏,若胚胎存活率和囊胚发育率20~100%(野生型B6小鼠胚胎复苏率在80%以上,不同品系间存在差异),或胚胎移植后有健康小鼠出生,表明胚胎冷冻保存成功。若2-cell复苏存活率小于50%,我们会及时与客户沟通,更改为8-cell或桑囊胚期胚胎冻存。

⑤长期保存。验证保存成功的品系,放入专用的胚胎保存液氮罐中(一般分布于2个液氮罐),长期保存。


2.精子冻存 

精子冻存,在保种服务中广泛应用,其优势在于技术成熟,成本低,容易操作等特点。通过无菌手术分离可育雄鼠的附睾,在特定的溶液进行精子的游离,并加入专用的冷冻保护液,通过麦管冷冻保存在液氮中。

建议客户每个品系提供2~3只12周至4月龄的可育成年小鼠,冻存15~20支麦管的精液。

 

3.品系恢复

在基因修饰动物模型的使用过程中,由于各种原因造成该品系的繁育出现障碍,如由于老龄化造成精子活力的降低,或由于疾病或意外造成繁育期动物生命垂危,这时可以通过维通达提供胚胎复苏、精子复苏,或者辅助生殖技术进行动物品系的恢复。

(1)胚胎复苏

冻存的胚胎按照标准程序复苏后,移植到代孕大小鼠的输卵管或子宫内,得到活体后代的过程。

(2)精子复苏

体外受精是指将成熟的卵子和获能的精子在体外进行受精的过程。维通达有丰富的作体外受精的经验,建议精子活力大于30%时,直接采用体外受精方法复苏后代。

(3)辅助透明带切开体外受精

辅助透明带切开是指获得的精子活力小于30%时,精子不能顺利穿过透明带,采用传统的方法不能得到受精卵时,对卵母细胞的透明带进行打孔或切开,从而获得受精卵的方法。维通达可以采用Xyclone激光破膜仪进行透明带打孔,或者用专用的尖针将透明带切开,两种方法均可得到较高的受精率。