基本信息

品系建立

将人的原代肝细胞移植到doxycycline(Dox)诱导的URG®小鼠肝脏中，即获得人源化肝脏小鼠(Hu-URG)。

Hu-URG小鼠由4种基因修饰动物模型交配获得，包含2个转基因和2个基因敲除。构建方式如下：

首先，TRE-uPA 转基因小鼠与 Alb-rtTA 转基因小鼠交配获得Alb-rtTA/TRE-uPA 双阳性小鼠，通过 Dox 诱导，在该小鼠中检测到了uPA 表达和肝损伤[1]；其次，Alb-rtTA/TRE-uPA双阳性小鼠连续8代回交到NRG(NOD背景的Rag2nullIl2rgnull小鼠) 背景，获得Alb-rtTA/TRE-uPA/Rag2null/Il2rgnull小鼠(URG®)；最后，将人的原代肝细胞移植到Dox诱导的URG®小鼠肝脏中，即获得人源化肝脏小鼠Hu-URG®，移植窗口期不受限制。

Hu-URG®不诱导时 uPA并不表达，小鼠健康生长；当用Dox诱导时，Tet-On系统驱动的uPA 即在肝内表达，小鼠出现肝损伤。作为新一代的可调控肝损伤人源化肝脏小鼠模型[2-6]，人源肝脏细胞可以实现20-95%整肝重建。

表型信息

1. 外周血相关蛋白及血脂检测

图1. Hu-URG®小鼠外周相关蛋白及血脂检测

 2. 人肝细胞重建水平

                                                         C                                                          D

图2. Hu-URG®小鼠人肝细胞重建

注：(A,B) HE 染色证明人肝细胞在 Hu-URG®小鼠肝脏中重建成功，染色浅的部分为人肝脏细胞；(C) Hu-URG®的外周血人Alb 水平；(D) Hu-URG®外周血Alb水平与人肝细胞嵌合程度相关性分析

3. 肝脏五叶区人肝细胞嵌合分析

图3. Hu-URG®小鼠肝脏五叶区人肝细胞嵌合分析

Hu-URG®小鼠不同肝叶的人白蛋白抗体免疫组化染色显示，人肝细胞均匀嵌合于肝脏五个叶区。

4. 肝脏人源肝细胞特有基因与蛋白表达分析

图4. Hu-URG®小鼠构建成功6周后肝脏组织检测分析

注：(A)肝qRT-PCR 分析表达人特异的基因；(B,C,D,E)人 Albumin, CK18, CYP3A4, CYP1A2免疫组化染色阳性

5. 感染人类专嗜的乙肝病毒(HBV)

图5. Hu-URG®小鼠支持人HBV病毒感染

Hu-URG®小鼠血清中HBV病毒滴度随感染时间延长逐渐升高，证明HBV病毒在模型内复制，同时进行染色发现HBV表面抗原和核心抗原染色阳性。

6. Hu-URG®小鼠药物代谢和药物相互作用的体内研究

图6. 药物在Hu-URG®小鼠肝脏中的代谢更接近人类

注：(A)利福平在Hu-URG®小鼠肝脏中诱导P450家族CYP酶和转运体蛋白的升高；(B)Dextromethophan在Hu-URG小鼠更快地代谢成dextrophan.

Hu-URG®小鼠感染HBV及药效研究实例

1. Hu-URG®用于研究HBV患者血清感染后小分子化合物抗病毒活性及其对cccDNA转录的潜在影响机制[7]

图7. Dicoumarol对HBV感染Hu-URG®小鼠的抗病毒活性

Hu-URG®小鼠（n=4/group）静脉注射50 μL HBV患者血清(基因型 B, 5.12×106 copies/mL)。6周后，每隔一天腹腔注射20 mg/kg Dicoumarol，同时设置对照组。每周眼眶静脉窦取血。给药35 d后处死小鼠，收集肝脏组织进行分析。结果表明：Hu-URG小鼠血清中Alb一直处于较高水平。在给药Dicoumarol治疗的5周内高于3 mg/mL，与对照组无显著差异。Dicoumarol 处理可有效降低血清 HBsAg和HBV DNA水平，并降低肝内HBV DNA和HBV RNAs水平。

2. Hu-URG®小鼠用于研究培养的HBV病毒颗粒感染后化合物抗病毒活性及其对cccDNA转录影响[8]

图8. Sphondin对HBV感染Hu-URG小鼠的抗病毒活性

Hu-URG®小鼠（n=4/group）静脉注射患者血清(基因型B)。8周后，将小鼠随机分为对照组、sphondin单药治疗组和ETV+sphondin 联合组，按照如图设计给药取材。结果表明：Hu-URG®小鼠血清中人Alb一直处于较高水平。在单独或联合给药治疗的6周内高于3 mg/mL，与对照组无显著差异。给药处理对体重也无显著影响。sphondin治疗可使血清 HBsAg和HBV DNA显著降低。同样也能显著降低肝内总HBV RNA、3.5 kb RNA、HBsAg和HBx蛋白水平。

3. Hu-URG®用于研究HBx通过DDB1介导的WDR77在肝脏中的降解增强HBV复制[9]

图9. HBV感染导致WDR77水平下降

PHHs通过脾内注射至3周龄URG®小鼠中（n=3/group），ELISA法测定血清人Alb，评估PHHs的植入和活力。然后用2.5×108 IU/mL (0.2 mL/只)HBV颗粒感染小鼠，8周后处死小鼠。结果表明：Hu-URG®小鼠血清中Alb处于较高水平且可正常感染HBV，HBV感染和HBx表达显著降低了Hu-URG®的WDR77的蛋白水平，进而限制cccDNA转录和HBV复制。

4. Hu-URG®用于研究药物治疗慢性乙肝的潜在靶点[10]

图10. PARP1抑制剂(olaparib)处理的 Hu-URG®小鼠HBV cccDNA 减少

9只雄性小鼠（n=4 male mice in mock group, n=5 male mice in olaparib group）静脉注射 HBV患者血清50 μL (5×108 copies/mL)。在HBV感染12小时后以每天50 mg/kg的剂量腹腔给药稀释的PARP1抑制剂olaparib。结果表明：Hu-URG®在DMSO组和olaparib组的体重和血清人Alb水平无显著差异。给药后导致血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平显著降低。肝内HBV cccDNA水平降低一半。这些数据表明olaparib可减少体内HBV复制和cccDNA的形成。

5. Hu-URG®用于研究IFN-α介导HDAC3抑制HBV转录和复制的通路研究[11]

图11. IFN-α介导HDAC3抑制HBV的转录和复制

原代人肝细胞(PHH)移植到3周龄(n=5 each group, male and female)URG®小鼠，构建产生Hu-URG®小鼠。然后用来自HepAD38细胞上清液5.0×108 IU/mL (0.2mL/小鼠)HBV颗粒进行感染Hu-URG®小鼠。结果表明：人肝嵌合小鼠血清中Alb处于较高水平且可正常感染 HBV，感染HBV的Hu-URG®小鼠中的HDAC3 mRNA水平较对照组显著降低，Western blot分析证实组蛋白H4K8 2-羟基异丁酰化水平明显增强。ChIP分析显示，HDAC3与HBV感染的Hu-URG®小鼠肝脏中的HBV cccDNA结合，这表明HDAC3锚定在HBV cccDNA染色体上。本研究发现IFN-α通过促进HDAC3介导的肝脏HBV cccDNA染色体上组蛋白H4K8的去2-羟基异丁酰化来抑制HBV转录和复制。

Hu-URG®小鼠应用领域

1. Hu-URG®小鼠可用于人特异的肝病、药物安全性评估和人特异的肝脏代谢酶相关的研究

2. HBV，HCV感染及抗病毒活性信号通路研究

3. 药物代谢与药代动力学、药效研究

4. 干细胞研究

5. 基因治疗

参考文献

1. Song X J, et al. A Mouse Model of Inducible Liver Injury Caused by Tet-On Regulated Urokinase for Studies of Hepatocyte Transplantation. Am J Pathol. 2009, 175(5):1975-1983.

2. Du Y, et al. Human hepatocytes with drug metabolic function induced from fibroblasts by lineage reprogramming. Cell Stem Cell. 2014, 14(3):394-403.

3. Azuma, H. et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- mice. Nat Biotechnol. 2007, 25(8):903-910.

4. Bissig KD, et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 2010, 120(3):924-930.

5. Xu D, et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. J Pharmacol Exp Ther. 2015, 352(2):274-280.

6. Foquet L, et al. Successful Engraftment of Human Hepatocytes in uPA-SCID and FRG® KO Mice. Methods Mol Biol. 2017, 1506:117-130.

7. Cheng ST, et al. Dicoumarol, an NQO1 inhibitor, blocks cccDNA transcription by promoting degradation of HBx. J Hepatol. 2021, 74:522-534.

8. Ren F, et al. Sphondin efficiently blocks HBsAg production and cccDNA transcription through promoting HBx degradation. J Med Virol. 2023, 95:e28578.

9. Yuan H, et al. HBx represses WDR77 to enhance HBV replication by DDB1-mediated WDR77 degradation in the liver. Theranostics. 2021, 11(17):8362-8378.

10. Chen Y, et al. DNA Repair Factor Poly (ADP-Ribose) Polymerase 1 Is a Proviral Factor in Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA Formation. J Virol. 2022, 96(13):e0058522.

11. Zhao LN, et al. IFN-α inhibits HBV transcription and replication by promoting HDAC3-mediated de-2-hydroxyisobutyrylation of histone H4K8 on HBV cccDNA minichromosome in liver. Acta Pharmacol Sin. 2022, 43(6):1484-1494.